分子生物學(xué)技術(shù)概述--質(zhì)粒DNA純化的試驗(yàn)原理是什么？快來(lái)跟小編看看自己有沒(méi)有掌握吧！

歷史方法

溴化乙錠通過(guò)嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多溴化乙錠，直至達(dá)到飽和( 每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫——溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中最好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級(jí)沉淀法。

從大腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其分離的依據(jù)可利用分子大小不同，堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。堿基性法抽提效果良好，既經(jīng)濟(jì)且得率較高。抽提到的質(zhì)量DNA可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化。對(duì)于分子量較大拷貝較少對(duì)的質(zhì)粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定且獲得的質(zhì)量DNA是超螺旋構(gòu)型等特點(diǎn)。對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，用少量制備法抽提質(zhì)粒DNA就有足夠量可用于基因操作。

最新方法

最近已得到改進(jìn)（R.Treisman,個(gè)人通訊）并達(dá)到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級(jí)沉淀法與氯化銫——溴化乙錠梯度平衡離心法有一點(diǎn)不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開(kāi)，因此， 純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒（大于15kb）。用于生物物理學(xué)測(cè)定的閉環(huán)質(zhì)粒時(shí)，平衡離心仍是首選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足以勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體。

氯化銫——溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA。

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