常見細菌的鑒定辦法

（一）實驗原理

細菌對大分子的淀粉、蛋白質和脂肪不能直接利用，必須靠產生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶將大分子物質分解。胞外酶能分泌擴散到細胞外，將物質分解成小單位如糖、氨基酸、甘油與脂肪酸。這些小單位的物質能被細菌吸收和利用。水解過程可通過底物的變化來證明，如細菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測定不再產生藍色；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂肪水解后產生脂肪酸改變培養(yǎng)基的pH，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色。

（二）實驗方法

將淀粉培養(yǎng)基溶化后，冷至45℃左右，以無菌操作制成平板。

取18-24h的純培養(yǎng)物點于平板上，每皿可點種3-5個菌株，適溫培養(yǎng)2-4d，形成菌落后，在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板成藍色。如果菌落周圍有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經被水解，實驗為陽性，否則為陰性。透明圈的大小一般說明水解淀粉的能力。

（三）實驗試劑的配制

肉湯蛋白胨瓊脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2。

淀粉培養(yǎng)基制法：在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2％的可溶性淀粉，校正pH值至7.6，分裝三角瓶，121℃ 20min滅菌備用。

盧戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。

二糖發(fā)酵試驗

(一)實驗原理

單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內，使其最終濃度為0.75-1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細菌經37℃培養(yǎng)18-24小時，若能分解糖產酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO2和H2等氣體形成，小倒管內則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。

(二)實驗材料

1．菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2．培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。

(三)實驗方法

1．將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵管內。

2．置37℃孵箱培養(yǎng)18-24小時。

3．觀察結果：由于一些細菌能分解某種糖類產酸，所以培養(yǎng)基中pH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產酸者以“+”表示，如果同時產生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內有氣泡出現(xiàn)，此乃產酸又產氣，以“⊕”表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

(四)實驗結果

傷寒桿菌大腸桿菌

葡萄糖 + ⊕

乳 糖 - ⊕

(五)實驗試劑的配制

1.單糖發(fā)酵管的制備： 成分：蛋白胨水培養(yǎng)基 100ml ，0.2%酚紅 1ml ，所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g

制法：

（1）將上述成分溶化，混勻分裝于內含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約2ml，加塞。

（2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩?/p>

用途：供單糖發(fā)酵試驗用。

2.0.2%酚紅配制法

酚紅（phenol red）0.2g ，0.lmol/LNaOH 8ml ，蒸餾水 92ml

將酚紅入研缽徐徐加入0.lmol/LNaOH研磨，再補足蒸餾水即成。若需長時間保存，可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?/p>

三甲基紅（M.R）試驗

(一)實驗原理

某些細菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基pH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應；若產酸量少或產生的酸進一步轉化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在pH 6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應。

(二)實驗材料

1.菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18-24h瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

3.試劑：甲基紅試劑。

(三)實驗方法

1.分別將大腸桿菌，產氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2-3天取出，分別滴加甲基紅試劑2-3滴，混勻，觀察結果。

(四)實驗結果

大腸桿菌：+，產氣桿菌：-。

(五)實驗試劑的配制

1．甲基紅試劑的配制

甲基紅 0.04g， 95%酒精 60ml ， 蒸餾水 40ml 。

先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。

2.葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物

成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g

制法：

（1）將上述成分溶解于蒸餾水中。

（2）調節(jié)pH至7.6，用濾紙過濾除渣。

（3）分裝中試管，每管約3-4ml，滅菌后備用。

用途：供甲基紅及V-P試驗用。

四產吲哚（indole）試驗

(一)實驗原理

某些細菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產生靛基質（無色吲哚），再與歐立希試劑（對二甲基氨基苯甲醛）反應，形成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性反應。

(二)實驗材料

1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。

3.試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對二甲基氨基苯甲醛）

(三)實驗方法

1.分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2-3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑0.5-1ml于培養(yǎng)液面上，待1-2分鐘后觀察結果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為吲哚試驗陽性，無紅色環(huán)即為陰性。

(四)實驗結果

大腸桿菌：+ ；傷寒桿菌：- 。

(五)實驗試劑的配制

1.蛋白胨水培養(yǎng)基的制備

成分：蛋白胨10g 氯化鈉5g 蒸餾水1000ml

制法：

（1）先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量。

（2）調節(jié)pH至7.6、用濾紙過濾。

（3）分裝中試管，每管約3-4ml，加塞滅菌后備用。

2.歐立希（Ehrlich）試劑的配制

對位二甲基氨基苯甲醛 4g

95%酒精 380ml

濃硫酸或濃鹽酸80ml

三種成分混合即成，瓶口要嚴密，以免揮發(fā)。

五硝酸鹽還原試驗

(一)硝酸鹽還原試驗原理：

硝酸鹽還原反應包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉化為氨基酸和細胞內其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產物。但硝酸鹽還原的過程因細菌不同而異，有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌；有的細菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗系測定還原過程中所產生的亞硝酸鹽。

(二)培養(yǎng)基：

硝酸鹽培養(yǎng)基。

(三)試劑：

甲液（對氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml）；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸100ml）。

(四)方法：

被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)1～4d。將甲、乙液等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內，立即觀察結果。

(五)結果：

出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應，可能是：①硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性；②硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產物而導致假陰性結果，這時應在試管內加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產生紅色，表示試驗為假陰性。

若要檢查是否有氮氣產生，可在培養(yǎng)基管內加一小倒管，如有氣泡產生，表示有氮氣生成。

(六)應用：

本試驗在細菌鑒定中廣泛應用。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。

(七)實驗試劑的配制

硝酸鹽液體培養(yǎng)基

蛋白胨5.0g，KNO3 0.2g, 蒸餾水1000 mL，pH7.4，每管分裝4-5mL，121℃滅菌15-20min。

六產氨實驗（尿素分解實驗）

(一)實驗原理

某些細菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產生氨，氨溶于水變成氫氧化銨，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽性。

(二)實驗材料

1.菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。

(三)實驗方法

1.分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。

2.置37℃培養(yǎng)18-24小時。

3.取出觀察結果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗陽性，若不變色，即為尿素分解試驗陰性。

(四)實驗結果

變形桿菌：+ ；傷寒桿菌：- 。

(五)實驗試劑的配制

1.尿素培養(yǎng)基的制備

成分： 蛋白胨1g 、氯化鈉5g、葡萄糖1g、蒸餾水900ml、瓊脂15-20g 、0.1%酚紅 12ml 、20%尿素水溶液（無菌）100ml 。

制法：（1）除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正pH至6.8-6.9。

（2）加入瓊脂和酚紅，115℃磅滅菌10min。

（3）冷卻至60℃后加入無菌尿素溶液，搖勻。

（4）分裝中試管（無菌），每管3-4ml，置成斜面?zhèn)溆谩?/p>

說明：（1）尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。

2.無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g，混合于100ml蒸餾水中，充分搖勻，用G6濾菌器過濾除菌，以達到無菌的目的。

七檸檬酸鹽利用試驗

(一)實驗原理

本試驗用于檢測細菌利用檸檬酸的能力。細菌利用檸檬酸鹽的能力不同，如各種腸細菌可利用檸檬酸為碳源，而大腸埃希氏菌則不利用檸檬酸鹽。因此，能否利用檸檬酸鹽是一項鑒別性特征。培養(yǎng)基中含有檸檬酸鈉時，如將檸檬酸分解為CO2，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子呈堿性，使培養(yǎng)基中酚紅指示劑（pH6.8-8.4，黃→紅）由淡粉紅色變?yōu)槊倒寮t色以識別之。

(二)材料

檸檬酸鈉2g、K2HPO4 1g、NH3H2PO4 1g、NaCl 5g、MgSO4 0.2g、瓊脂 1.5 2g、1%溴麝香草酚藍(酒精溶液)或0.04%苯酚紅 10ml、水 1000ml

將上述各成分加熱溶解后，調PH6.8，然后加入酚紅指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾。制成后為黃綠色，分裝試管。121℃滅菌20min后制成斜面。

(三)實驗內容

1.將試驗菌在斜面上劃線接種，適溫培養(yǎng)3-5天。

2.若該菌能利用檸檬酸鹽，則可在此斜面上生長并將培養(yǎng)基由原來的淡粉紅色變?yōu)槊倒寮t色，此為陽性；顏色不變者為陰性。

八油脂水解試驗

(一)原理

某些細菌能夠分泌脂肪酶（胞外酶），能將培養(yǎng)基中的脂肪水解為甘油和脂肪酸。所產生的脂肪酸，可通過預先加入油脂培養(yǎng)基中的中性紅加以指示[指示范圍pH6.8（紅）～pH8.0（黃）]。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點。

(二)實驗內容

1.將裝有油脂培養(yǎng)基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩（使油脂均勻分布），再傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后制成平板。

2.翻轉平板使底皿背面向上，用記號筆在其背面玻璃上劃成兩半。一半用于接種金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，另一半用于接種實驗菌大腸桿菌或產氣腸桿菌。接種時用接種環(huán)取少量菌在平板兩邊各劃線接種。

3.將接種完的平板倒置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h。

4.觀察結果時，注意觀察平板上長菌的地方，如出現(xiàn)紅色斑點，即說明脂肪已被水解，此為陽性反應。

（三）培養(yǎng)基配制

油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，香油或花生油10g，中性紅（1.6%水溶液）約0.1ml，瓊脂15-20g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃滅菌20min。

九接觸酶試驗

(一)實驗原理

本試驗用于檢測細菌是否具有接觸酶活性。接觸酶又稱為過氧化氫酶，是一種以正鐵血紅素作為輔基的酶，能將過氧化氫分解為水和氧。一般好氧細菌與兼性厭氧細菌（除某些鏈球菌、乳酸桿菌等外）都能產生接觸酶，而厭氧細菌不產生接觸酶，這是用以區(qū)別好氧和厭氧菌的方法之一。

(二)材料

牛肉膏、蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，3%過氧化氫。

牛肉膏、蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1g、氯化鈉 0.5g、瓊脂 2g、自來水 100mL、pH 7.0～7.2 、滅菌。

(三)實驗內容

1.接種試驗菌，適溫下培養(yǎng)18-24小時。

2.將3%的過氧化氫滴于斜面菌苔上（或涂有菌苔的載玻片上），靜置1-3分鐘后，如有氣泡產生即為陽性。不產生氣泡者為陰性。

(四)應用

革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。

十革蘭氏染色

(一)實驗原理

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

(二)實驗方法

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

1.涂片固定。

2.草酸銨結晶紫染1分鐘。

3.自來水沖洗。

4.加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。

5.水洗，用吸水紙吸去水分。

6.加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。

7.蕃紅梁色液（?。┤?分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

[染色的結果]：革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。

(三)應用

其重要的臨床意義在于：1.鑒別細菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關：：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素，兩者的致病作用不同。